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      本文從腫瘤的診療歷史談起，對(duì)腫瘤NGS檢測(cè)包括NGS測(cè)序的歷史進(jìn)行梳理，讓大家能夠從耳熟能詳或鮮為人熟知的歷史事件中了解這個(gè)行業(yè)發(fā)展的脈絡(luò)。溫故而知新，希望這些在腫瘤診療發(fā)展歷程中作出過(guò)重大貢獻(xiàn)的人物和事件，不會(huì)隨風(fēng)而逝，反而能激勵(lì)后人持續(xù)創(chuàng)新、續(xù)創(chuàng)輝煌。所涉及到的內(nèi)容皆來(lái)源于平日積累和參考資料，有錯(cuò)漏之處歡迎斧正。

      目錄

      1.讓人談之色變的“螃蟹”

      2.腫瘤診療的發(fā)展里程碑

      3.基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展歷史

      4.基于NGS的腫瘤基因檢測(cè)

      5.技術(shù)創(chuàng)新驅(qū)動(dòng)腫瘤精準(zhǔn)診療

讓人談之色變的“螃蟹”

      公元前400多年，古希臘的“醫(yī)學(xué)之父”希波克拉底（前460年—前370年）觀察到人體內(nèi)有一種腫脹物能夠在體內(nèi)快速生長(zhǎng)，在擴(kuò)散過(guò)程中該腫脹物會(huì)伸出許多像手指一樣的觸角，形似螃蟹，故用螃蟹的拉丁語(yǔ)“carcinos”及“carcinoma”來(lái)命名這種疾病。約在300多年后，古羅馬學(xué)者塞爾蘇斯（前28年-前50）將眾多古希臘醫(yī)學(xué)經(jīng)典翻譯為拉丁語(yǔ)，在翻譯carcinos一詞時(shí)由于其原指螃蟹，故將其譯為Cancer（同樣意為螃蟹），但由于后世肥美的螃蟹經(jīng)常會(huì)走上人們的餐桌，為避免混淆，螃蟹逐漸被crab一詞所取代。由此，Cancer成為千百年來(lái)醫(yī)生為之頓足、百姓談之色變的名詞。

腫瘤診療的發(fā)展里程碑

      雖然很早就定義了癌癥這種疾病，但直到文藝復(fù)興之后，人們對(duì)于癌癥的認(rèn)識(shí)才逐漸深入。著名的蘇格蘭外科醫(yī)生約翰·亨特（John Hunter，1728-1793）曾提出，一些癌癥可以通過(guò)手術(shù)治愈，并描述了外科醫(yī)生如何決定手術(shù)治療哪些癌癥。威廉·哈爾斯特德（William Halsted）在1882年進(jìn)行了第一次根治性乳房切除術(shù)來(lái)治療乳腺癌。直到20世紀(jì)下半葉，這種外科手術(shù)仍然是乳腺癌的標(biāo)準(zhǔn)手術(shù)。

      人類(lèi)與癌癥的斗爭(zhēng)從未停止，隨著時(shí)間的推移，逐步發(fā)展出手術(shù)治療、激素治療、放療、化療、靶向治療和免疫治療等多種手段?；熕幬飳?duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性低，不能分辨腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞，對(duì)兩種細(xì)胞均會(huì)“格殺勿論，狂轟濫炸”，在殺滅癌細(xì)胞的同時(shí)也損傷了部分正常細(xì)胞，出現(xiàn)“殺敵一千，自損八百”的尷尬局面，且有較大的毒副作用。靶向治療就是在治療癌癥的時(shí)候，像射箭一樣，只針對(duì)患病的部分用藥，而不傷及健康的部分。而實(shí)現(xiàn)靶向治療的關(guān)鍵是如何找到靶子，也就是需要通過(guò)基因檢測(cè)來(lái)找到靶標(biāo)位置。免疫治療主要是激活人自身的免疫系統(tǒng)，讓免疫細(xì)胞去殺滅癌細(xì)胞和腫瘤組織。它直接作用的不是腫瘤細(xì)胞或組織，而是激活人體自身的免疫系統(tǒng)，最終殺死腫瘤細(xì)胞。免疫治療也不是針對(duì)所有患者都適用，同樣依賴(lài)于基因檢測(cè)進(jìn)行個(gè)體化治療。

      靶向治療到底有何神奇之處呢？我們通過(guò)兩個(gè)例子來(lái)感受一下。

      患者1

      73歲   女性

      先前診斷為早期乳腺癌，經(jīng)過(guò)乳房腫瘤切除術(shù)、放療及輔助他莫昔芬治療后順利出院。然而天有不測(cè)風(fēng)云，3年后病人出現(xiàn)了憋氣癥狀，到醫(yī)院檢查發(fā)現(xiàn)腫瘤已廣泛侵及頸部、肺部和胸膜，經(jīng)診斷為乳腺癌晚期?？紤]到患者的年齡和癌癥轉(zhuǎn)移情況，常規(guī)的手術(shù)治療和放化療都不適合?；颊吆图覍俦緛?lái)已經(jīng)不抱太大希望，只希望后續(xù)治療能減輕點(diǎn)痛苦。但由于患者持續(xù)性呼吸困難，主治醫(yī)生將患者腫瘤組織進(jìn)行了基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞具有BRAF V600E突變。在醫(yī)生的建議下，患者接受了靶向藥物維羅非尼（Vermurafenib）治療。僅過(guò)了大約1個(gè)月左右，患者呼吸困難癥狀明顯改變；2個(gè)月后，進(jìn)一步的PET成像顯示之前頸部和胸部的轉(zhuǎn)移灶明顯縮小；6個(gè)月后，患者對(duì)維羅非尼的耐受良好，PET顯像進(jìn)一步表明疾病明顯減輕；23個(gè)月后患者仍服用該藥治療，疾病狀況控制良好，幾乎不伴有與其腫瘤相關(guān)的癥狀了。

      患者2

      轉(zhuǎn)移性肺癌患者

      前期通過(guò)基因檢測(cè)明確是NTRK基因融合，很幸運(yùn)可以參加拉羅替尼治療的臨床試驗(yàn)。2015年3月，剛剛加入這場(chǎng)試驗(yàn)的時(shí)候，患者只能依靠輪椅來(lái)移動(dòng)，憑借吸氧機(jī)呼吸，因?yàn)檗D(zhuǎn)移病灶占據(jù)了她90%的肺。很快，“奇跡”開(kāi)始上演。開(kāi)始服藥的三天內(nèi)，患者能夠坐起來(lái)，并且用完整的句子講話。服藥一個(gè)月，患者摘掉了呼吸機(jī)。服藥六個(gè)月后，患者甚至可以騎馬了。通過(guò)三年的隨訪，影像學(xué)檢查顯示均沒(méi)有癌癥的跡象。

      這兩位患者都是前期進(jìn)行了基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了具有靶向藥物治療的靶點(diǎn)突變，隨后進(jìn)行靶向治療，達(dá)到了非常好的療效。

      吉非替尼

      （gefitinib，商品名易瑞沙）

      最早出現(xiàn)的靶向治療藥物，它的上市過(guò)程頗有一番曲折。1998年，一期臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)部分化療后進(jìn)展NSCLC患者對(duì)易瑞沙反應(yīng)非常迅速，腫瘤明顯縮小。2002年阿斯利康將易瑞沙率先在日本上市，2003年FDA批準(zhǔn)在美國(guó)上市。然而，在III期的ISEL臨床試驗(yàn)中，在1692名患者中，吉非替尼并沒(méi)有較安慰劑表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)。2005年FDA不允許吉非替尼在新患者中使用，基本上宣告了吉非替尼在美國(guó)市場(chǎng)的結(jié)束。同年阿斯利康也撤回了吉非替尼在歐洲的上市申請(qǐng)。2011年阿斯利康主動(dòng)宣布在美國(guó)市場(chǎng)將吉非替尼撤市。

      另一方面，從2004年開(kāi)始，科研人員發(fā)現(xiàn)吉非替尼在某些特定人群中，比如亞洲人群或者非吸煙者人群，有更好的療效。通過(guò)多年的不懈努力，科研人員最終發(fā)現(xiàn)吉非替尼的療效和EGFR的基因突變有關(guān)。并通過(guò)多項(xiàng)臨床試驗(yàn)奠定了吉非替尼一線治療在EGFR基因具有敏感突變的局部晚期或轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌中的地位。2009年，歐盟批準(zhǔn)易瑞沙用于EGFR突變的非小細(xì)胞肺癌的各線治療， 2015年，易瑞沙又重新回到了美國(guó)市場(chǎng)。通過(guò)基因檢測(cè)，將腫瘤病人在分子水平進(jìn)行分型，可以篩選出藥物治療有效的病人?；驒z測(cè)挽救了一個(gè)投入巨大的藥物，更重要的是，給罹患腫瘤的患者帶來(lái)了新的希望。

      隨后，以阿法替尼為代表的二代靶向EGFR突變藥物上市，讓眾多患者受益。然而，幾乎所有腫瘤都會(huì)對(duì)藥物產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致癌癥繼續(xù)發(fā)展。通過(guò)基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，大約三分之二的耐藥患者出現(xiàn)EGFR T790M突變，相對(duì)應(yīng)開(kāi)發(fā)的三代藥物如奧希替尼可以靶向EGFR T790M突變的腫瘤細(xì)胞，進(jìn)一步延長(zhǎng)癌癥患者的生存時(shí)間。隨著研究的不斷深入，新的靶向藥物不斷地被開(kāi)發(fā)，以解決不斷進(jìn)化的腫瘤。任何一款靶向藥物的使用之前都需要進(jìn)行基因檢測(cè)，以明確患者是否可以從中獲益。

      O藥&K藥

      （Nivolumab，歐狄沃&Pembrolizumab，可瑞達(dá)）

      除了靶向藥物，近年來(lái)，基于免疫檢查點(diǎn)抑制劑的免疫治療大放異彩，成為人類(lèi)在攻克腫瘤道路上獲得的新武器。腫瘤細(xì)胞通過(guò)免疫檢查點(diǎn)分子實(shí)現(xiàn)免疫逃逸，免疫治療通過(guò)對(duì)免疫檢查點(diǎn)分子的抑制激活自身免疫反應(yīng)，消滅腫瘤細(xì)胞。

      FDA于 2011 年批準(zhǔn)抗CTLA-4的伊匹木單抗上市，用于晚期黑色素瘤患者的治療，成為全球首個(gè)免疫檢查點(diǎn)抑制劑藥物。PD-1/PD-L1是明星免疫檢查點(diǎn)抑制劑，大名鼎鼎的O藥（納武利尤單抗）和K藥（帕博利珠單抗）都是PD-1抑制劑。2014年6月O藥在日本獲得批準(zhǔn)用于治療黑色素瘤，成為全球第一個(gè)被批準(zhǔn)的PD-1抑制劑；同年7月和9月，F(xiàn)DA先后批準(zhǔn)了O藥和K藥用于治療黑色素瘤。

      PD-1療法的聲名大噪，美國(guó)前總統(tǒng)吉米·卡特也助了一臂之力。2015年，91歲的卡特被診斷出患惡性黑色素瘤，而且已經(jīng)發(fā)生了肝轉(zhuǎn)移、腦轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，已經(jīng)是個(gè)不折不扣的晚期患者了。卡特經(jīng)過(guò)4個(gè)月的K藥治療，腦部的腫瘤神奇般地消失！如今卡特已達(dá)98歲高齡，成為美國(guó)歷史上最長(zhǎng)壽的總統(tǒng)。

      目前，國(guó)產(chǎn)PD-1/PD-L1抑制劑已經(jīng)有多款產(chǎn)品上市，進(jìn)入集采后，整體的價(jià)格非常親民，患者大大獲益。O藥和K藥都是可以不區(qū)分癌種用藥的，這是一個(gè)里程碑似的結(jié)果。但是，PD-1/PD-L1抑制劑并不能百發(fā)百中，解決所有問(wèn)題。首先，在某些病種中有效率低于20%。其次，有時(shí)候副作用比較大，甚至有三級(jí)和四級(jí)副作用。此外，由于存在免疫超進(jìn)展，并不是所有人都適合PD-1/PD-L1藥物。免疫治療之前，同樣也離不開(kāi)基因檢測(cè)，需要在用藥前進(jìn)行MSI、TMB基因檢測(cè)、免疫超進(jìn)展相關(guān)檢測(cè)以及PD-L1的免疫組化檢測(cè)。

      隨著人類(lèi)對(duì)腫瘤研究的不斷深入，抗腫瘤藥物的不斷發(fā)展，對(duì)于腫瘤的治療進(jìn)入了精準(zhǔn)醫(yī)療階段。腫瘤存在高度異質(zhì)性，不同患者間在疾病進(jìn)展、治療敏感性及預(yù)后等方面的差別巨大，對(duì)腫瘤的診斷從傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分型轉(zhuǎn)變到分子分型，可實(shí)現(xiàn)“同病異治”或“異病同治”?；驒z測(cè)有助于癌癥的精準(zhǔn)診斷、預(yù)測(cè)和預(yù)后、治療指導(dǎo)、復(fù)發(fā)監(jiān)控及藥物研發(fā)，從而使得患者獲益最大化。

      我國(guó)腫瘤基因檢測(cè)的市場(chǎng)也逐年增加，基因檢測(cè)的高速發(fā)展，離不開(kāi)檢測(cè)技術(shù)，尤其是NGS技術(shù)的不斷發(fā)展以及成本的不斷下降。

基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展歷史

      2001年

      6個(gè)國(guó)家的科學(xué)家花了11年的時(shí)間、30億美元，共同發(fā)表首個(gè)人類(lèi)基因組工作草圖。

      2003年

      全世界最早的人類(lèi)全基因組參考序列公布，宣布完成人類(lèi)基因組計(jì)劃。人類(lèi)基因組測(cè)序的完成，極大地推動(dòng)了基因檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展。

      2005年

      454 Life Sciences 推出了第一款二代測(cè)序儀，開(kāi)啟了二代測(cè)序的先河。454技術(shù)是基于焦磷酸測(cè)序法的超高通量基因組測(cè)序系統(tǒng)，是一種邊合成邊測(cè)序（sequencing by synthesis, SBS）的技術(shù)，比傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序快100倍。454 Life Sciences用新一代測(cè)序儀對(duì)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)者James Watson進(jìn)行了基因組測(cè)序。

      2006年

      ·英國(guó)劍橋的Solexa公司推出基于邊合成邊測(cè)序（sequencing by synthesis, SBS）技術(shù)的高通量測(cè)序儀。

      ·ABI斥資1.2億美元收購(gòu)了遺傳分析公司Agencourt Personal Genomics（APG）。

      2007年

      ·Roche（羅氏）以1.55億美元現(xiàn)金和股票收購(gòu)了454 Life Science，為Roche在此后幾年成為二代測(cè)序市場(chǎng)的領(lǐng)頭羊奠定基礎(chǔ)。

      ·Roche完成對(duì)雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)者James Watson的基因組測(cè)序，花費(fèi)100萬(wàn)美金。

      ·Illumina以6億美元收購(gòu)Solexa，開(kāi)啟二代測(cè)序新紀(jì)元。

      ·ABI推出SOLiD高通量測(cè)序儀，SOLiD系統(tǒng)是通量最高的新一代測(cè)序平臺(tái)，每次運(yùn)行可以產(chǎn)生4 Gb的數(shù)據(jù)。此外，由于它采用雙堿基編碼技術(shù)，在測(cè)序過(guò)程中對(duì)每個(gè)堿基判讀兩遍，能夠區(qū)分測(cè)序錯(cuò)誤和多態(tài)性，故原始數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性接近99.95%，高于其他的新一代測(cè)序平臺(tái)。

      2008年

      ·Illumina宣布將人類(lèi)基因組測(cè)序費(fèi)用降至10萬(wàn)美元。

      ·ABI宣布，利用SOLiD測(cè)序平臺(tái)，人類(lèi)基因組的測(cè)序成本低于6萬(wàn)美元。

      2010年

      ·Illumina推出HiSeq2000系列測(cè)序儀，在測(cè)序通量上做了長(zhǎng)遠(yuǎn)的布局。

      ·454 Life Sciences的創(chuàng)始人喬納森·羅森伯格（Jonathan Rothberg）創(chuàng)辦了新的科技公司Ion Torrent，并于2010年成功推出了當(dāng)時(shí)世上體積最小、檢測(cè)成本最低的測(cè)序儀PGM。

      ·Ion Torrent被Life Technologies公司收購(gòu)。而這家Life Technologies公司，正是由ABI公司與Invitrogen公司合并而成！Life technologies的Ion Torrent表現(xiàn)不俗，在NGS競(jìng)爭(zhēng)中扳回一局。

      2014年

      Life Technologies 又被 Thermo Fisher Scientific Corporation（賽默飛世爾） 以136億美元收購(gòu)。Thermo Fisher Scientific可以量產(chǎn)臨床級(jí)別的測(cè)序儀，占據(jù)了一定的市場(chǎng)份額。

      2016年

      Roche在Illumina的通量和價(jià)格的雙重夾擊下遭受沉重的打擊，黯然宣布關(guān)閉454。

      2017年

      Illumina將人類(lèi)基因組測(cè)序成本降低到了1000美元，率先實(shí)現(xiàn)了“一千美元測(cè)序一個(gè)人類(lèi)基因組”的設(shè)想。

      由此，Illumina壟斷了超過(guò)80%的NGS測(cè)序市場(chǎng)，緊隨其后的Themo Fisher市場(chǎng)占有率僅為不到10%，Roche僅為5%左右，排名前三的廠商總市場(chǎng)占比超過(guò)98%。

      近幾年國(guó)產(chǎn)測(cè)序平臺(tái)華大智造在NGS領(lǐng)域也占得了一席之地。華大和Illumina的競(jìng)爭(zhēng)更多的是專(zhuān)利的競(jìng)爭(zhēng)。

      2013年華大基因開(kāi)展了收購(gòu)Complete Genomics的進(jìn)程。CG位于美國(guó)加州山景城，是頂尖的人類(lèi)全基因組測(cè)序服務(wù)商。但是CG長(zhǎng)于技術(shù)，卻短于經(jīng)營(yíng)。導(dǎo)致當(dāng)時(shí)CG的資金鏈一天天抽緊，一旦扛不住宣布破產(chǎn)，即進(jìn)入破產(chǎn)拍賣(mài)程序，華大將失去機(jī)會(huì)，Illumina將壟斷整個(gè)市場(chǎng)。CG的老對(duì)手Illumina此時(shí)向美國(guó)加州南區(qū)地方法院提起訴訟，控告CG侵犯其專(zhuān)利權(quán)，打算借此機(jī)將CG拖入破產(chǎn)程序。

      華大以暗拍的方式參與了收購(gòu)競(jìng)拍。他們最終給出的價(jià)格是每股3.15美元，而Illumina給出的價(jià)格是3.1美元，二者僅有5分錢(qián)的差距。但是誰(shuí)也沒(méi)想到，競(jìng)拍數(shù)月之后，Illumina不甘心就此出局，帶著3.3美元的最新出價(jià)又殺了回來(lái)。Illumina此時(shí)開(kāi)始在媒體造勢(shì)，聲稱(chēng)將CG賣(mài)給中國(guó)人等于泄露“可口可樂(lè)的秘方”，CG的一些股東借機(jī)表示華大開(kāi)價(jià)過(guò)低，損害了股東利益，質(zhì)疑CG管理層和董事會(huì)成員確定買(mǎi)家太過(guò)草率。華大逐字逐條、有理有據(jù)地回應(yīng)了Illumina對(duì)華大的指控，說(shuō)明為何華大基因的收購(gòu)最有利于股東、客戶以及雇員的利益，并質(zhì)疑Illumina的收購(gòu)僅僅是為了扼殺測(cè)序儀市場(chǎng)的競(jìng)爭(zhēng)。

      最終，華大沒(méi)有因?yàn)镮llumina的報(bào)價(jià)而動(dòng)搖，3.15美元的出價(jià)分文沒(méi)漲。2013年3月18日，美國(guó)外國(guó)投資委員會(huì)最終批準(zhǔn)了華大基因?qū)G的并購(gòu)申請(qǐng)。

      華大和Illumina的專(zhuān)利之爭(zhēng)，并未就此結(jié)束。

      2019年5月，硝煙四起的專(zhuān)利戰(zhàn)爭(zhēng)進(jìn)一步打響，華大智造美國(guó)子公司CG向美國(guó)特拉華州地區(qū)法院提起訴訟，起訴Illumina侵犯了CG的two-color測(cè)序?qū)＠?。隨后，Illumina于2019年7月25日提起反訴，主張CG US、華大智造和美洲智造侵犯其“修飾核苷酸”專(zhuān)利。

      經(jīng)過(guò)將近3年的拉鋸戰(zhàn)，2022年5月6日，特拉華州法院對(duì)華大智造訴Illumina專(zhuān)利侵權(quán)案，及Illumina對(duì)華大智造的反訴訟案作出判決：針對(duì)華大智造訴Illumina專(zhuān)利侵權(quán)案，法院判決Illumina對(duì)華大制造的“雙色測(cè)序技術(shù)（Two-color sequencing technology）”構(gòu)成故意侵權(quán)，并要求Illumina向華大智造賠償3.34億美元，折合人民幣超22億元，創(chuàng)造了中國(guó)公司在海外專(zhuān)利獲賠最大數(shù)額記錄。針對(duì)Illumina向華大智造提起的反訴，法院判決 Illumina宣稱(chēng)被侵權(quán)的三項(xiàng)專(zhuān)利全部無(wú)效。華大智造在這場(chǎng)持續(xù)了三年的專(zhuān)利權(quán)糾紛案中獲得了壓倒性勝利。判決結(jié)果一出，Illumina股價(jià)應(yīng)聲下跌14.63%，損失達(dá)到67.03457億美金（42.67美金*1.571億股），合人民幣446.88億元。

      得益于NGS技術(shù)的不斷更新和成本的不斷降低，腫瘤基因檢測(cè)的應(yīng)用場(chǎng)景越來(lái)越廣泛，檢測(cè)的基因數(shù)目和突變類(lèi)型越來(lái)越豐富，市場(chǎng)上也出現(xiàn)了利用不同技術(shù)、針對(duì)不同應(yīng)用場(chǎng)景的各種產(chǎn)品。

基于NGS的腫瘤基因檢測(cè)

      2015年1月，美國(guó)總統(tǒng)奧巴馬在國(guó)情咨文演講中宣布了美國(guó)的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)計(jì)劃，嘗試通過(guò)收集基因組學(xué)和其他分子信息為患者提供個(gè)性化醫(yī)療。隨后，中國(guó)科技部于2015年3月召開(kāi)了國(guó)家首次精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)戰(zhàn)略專(zhuān)家會(huì)議，并計(jì)劃在2030年前投入600億元加速中國(guó)精準(zhǔn)醫(yī)療的行業(yè)發(fā)展。

      截止目前，F(xiàn)DA已批準(zhǔn)的伴隨診斷產(chǎn)品已達(dá)45個(gè)，來(lái)自16個(gè)伴隨診斷公司。自從2016年首款NGS伴隨診斷產(chǎn)品上市，NGS因其檢測(cè)通量高、更節(jié)約樣本、可獲得更全面的信息、可分析MSI和TMB等多維度分子靶標(biāo)、能更準(zhǔn)確地指導(dǎo)臨床等優(yōu)點(diǎn)在腫瘤基因檢測(cè)的應(yīng)用中發(fā)展迅速。5年內(nèi)已有7個(gè)NGS產(chǎn)品獲得了FDA批準(zhǔn)。其中有3款是大panel產(chǎn)品，分別是FoundationOne CDx，F(xiàn)oundation Liquid和Guardant360；有1款是同源重組修復(fù)缺陷產(chǎn)品Myriad myChoice。

      國(guó)家藥監(jiān)局NMPA相繼批準(zhǔn)了15款基于NGS的多基因檢測(cè)試劑盒。值得注意的是，這些獲批的產(chǎn)品均檢測(cè)少數(shù)幾個(gè)基因，屬于小panel產(chǎn)品。但腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制復(fù)雜，隨著對(duì)腫瘤基因組研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)的與腫瘤治療相關(guān)的基因、標(biāo)志物也越來(lái)越多。實(shí)現(xiàn)腫瘤精準(zhǔn)分子分型需要檢測(cè)的基因、變異類(lèi)型越來(lái)越多，小panel產(chǎn)品很難滿足不斷發(fā)展的腫瘤基因檢測(cè)的各種場(chǎng)景。能一勞永逸實(shí)現(xiàn)對(duì)不同腫瘤的多方位檢測(cè)，這是美國(guó)FDA給基因檢測(cè)企業(yè)提出的要求。縱觀美國(guó)FDA批準(zhǔn)的腫瘤NGS檢測(cè)產(chǎn)品（Foudation Focus CDx BRCA ? Oncomine Dx Target Test ? Praxis Extended RAS Panel ? MSK-IMPACT 468基因 ? FoundationOne CDx 324基因），我們可以發(fā)現(xiàn)腫瘤NGS檢測(cè)的未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)一定是從單一癌種到多癌種，單基因到多基因，小panel到大panel。截止目前，國(guó)內(nèi)尚未有大Panel產(chǎn)品獲批。

      從適用范圍看，用于非小細(xì)胞肺癌治療的伴隨診斷試劑最多。CSCO指南針對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行EGFR突變、ALK融合、ROS1、RET融合及MET14外顯子跳躍的基因檢測(cè)進(jìn)行了I級(jí)推薦，針對(duì)BRAF V600E突變、KRAS突變、HER2擴(kuò)增/突變，MET擴(kuò)增以及NTRK融合的基因檢測(cè)進(jìn)行了II級(jí)推薦，針對(duì)基于NGS技術(shù)進(jìn)行TMB檢測(cè)進(jìn)行了III級(jí)推薦。相應(yīng)的伴隨藥物主要集中在吉非替尼、?？颂婺?、奧希替尼、克唑替尼等。

      在其它各類(lèi)腫瘤的各種指南中也有對(duì)基因檢測(cè)的廣泛推薦，并指導(dǎo)基因診斷產(chǎn)品服務(wù)于臨床，為患者謀求更大的獲益。

      當(dāng)前，腫瘤基因檢測(cè)產(chǎn)品主要針對(duì)組織樣本，可以通過(guò)病理學(xué)診斷找到腫瘤區(qū)域，獲得較高濃度的腫瘤DNA，檢測(cè)難度相對(duì)較低。另外，絕大部分產(chǎn)品都通過(guò)雜交捕獲法進(jìn)行建庫(kù)，測(cè)序步驟則幾乎相同，所以產(chǎn)品的靈敏度和特異性都比較接近，雖然各產(chǎn)品的生信分析方法不盡相同，其底層技術(shù)是類(lèi)似的。

      臨床上，很多身體虛弱的晚期腫瘤患者，沒(méi)辦法進(jìn)行手術(shù)和穿刺，或患者出現(xiàn)多處轉(zhuǎn)移，組織不是很好取，或取得的組織樣本量達(dá)不到基因檢測(cè)的需求。腫瘤基因檢測(cè)陷入了“巧婦難為無(wú)米之炊”的境地。此外，手術(shù)后的患者，術(shù)后的預(yù)后評(píng)估、輔助治療方案的評(píng)估、復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)等臨床關(guān)心的問(wèn)題，也需要通過(guò)基因檢測(cè)以獲得更多的指導(dǎo)。利用血液等體液樣本進(jìn)行的液體活檢，由于無(wú)創(chuàng)且可多次取樣，能很好地解決上述難題。

      2018年，美國(guó)Guardant Health公司發(fā)布了史上最大規(guī)模的ctDNA檢測(cè)研究結(jié)果，Guardant 360平臺(tái)檢測(cè)了15191例患者的17628份血漿標(biāo)本和398位患者的組織標(biāo)本，結(jié)果表明，液體活檢和組織檢測(cè)具有相當(dāng)高的一致性。2020年，F(xiàn)DA先后批準(zhǔn)了Guardant360 CDx和Foundation one CDx兩款通過(guò)液體活檢進(jìn)行腫瘤伴隨診斷的產(chǎn)品。

      無(wú)論是基于組織的檢測(cè)，還是液體活檢，腫瘤基因檢測(cè)的重要挑戰(zhàn)都是檢測(cè)的靈敏性和特異性。腫瘤基因檢測(cè)的操作步驟包括核酸的提取、PCR擴(kuò)增和測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建、基因序列讀取等。這些過(guò)程中都會(huì)帶來(lái)檢測(cè)誤差。檢測(cè)時(shí)如何排除掉誤差帶來(lái)的突變，真正能檢測(cè)出每個(gè)患者不同的突變，同時(shí)兼顧檢測(cè)覆蓋的基因范圍和檢測(cè)準(zhǔn)確度，這是腫瘤基因檢測(cè)的一個(gè)重要難點(diǎn)。此外，具有臨床指導(dǎo)意義的突變，即可訴性突變，在腫瘤組織中的占比常常較低，而在體液中更低（比如ctDNA中的突變）。為獲得準(zhǔn)確的可訴性突變信息，常常需要加大測(cè)序深度，這無(wú)可避免地造成了測(cè)序成本的提高。如何高特異性高靈敏度地檢測(cè)可訴性突變是基于NGS的腫瘤基因檢測(cè)的關(guān)鍵問(wèn)題。利用基于組織開(kāi)發(fā)的腫瘤基因檢測(cè)panel來(lái)檢測(cè)血液中的ctDNA，雖然在加大測(cè)序深度的情況下能一定程度提高測(cè)序的最低檢測(cè)下限，但由于雜交捕獲效率和樣本投入量的原因，很多低頻突變無(wú)法被捕獲，組織檢測(cè)產(chǎn)品應(yīng)用于液體活檢仍存在一些問(wèn)題。液體活檢的痛點(diǎn)，依賴(lài)于底層技術(shù)的突破。

技術(shù)創(chuàng)新驅(qū)動(dòng)腫瘤精準(zhǔn)診療

      閱爾基因發(fā)明了抑制探針置換擴(kuò)增技術(shù)（Blocker Displacement Amplification，BDA）。BDA在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上，額外增加了一條blocker探針，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)突變型序列富集。

      BDA就像一個(gè)放大鏡，特異地放大了組織內(nèi)突變型分子的信號(hào)，并大大抑制了野生型序列的擴(kuò)增，可以更便捷更省力地檢測(cè)到關(guān)鍵的信號(hào)。

      QASeq技術(shù)（Quantitative Amplicon Sequencing）是閱爾基因的另一項(xiàng)專(zhuān)利技術(shù)。QASeq是通過(guò)加唯一性分子標(biāo)簽（Unique Molecular Identifier, UMI）的方法，去除PCR和基因測(cè)序過(guò)程產(chǎn)生的錯(cuò)誤；并通過(guò)多重PCR設(shè)計(jì)，對(duì)DNA序列進(jìn)行絕對(duì)定量，大大提高拷貝數(shù)變異分析的靈敏度。此外，通過(guò)將擴(kuò)增子引物設(shè)計(jì)在熱點(diǎn)突變兩端，QASeq也可以檢測(cè)基因突變。

      BDA可以特異富集低頻突變，大大降低對(duì)野生型的不感興趣分子的擴(kuò)增，這樣的特征使得其特別適用于液體活檢、MRD監(jiān)測(cè)等需要超過(guò)靈敏度的應(yīng)用場(chǎng)景，使液體活檢真正走向?qū)嵱没?。閱爾基因研發(fā)團(tuán)隊(duì)將mBDA技術(shù)和QASeq技術(shù)整合，推出qBDA技術(shù)：首先在DNA分子加UMI標(biāo)簽，其次進(jìn)行mBDA擴(kuò)增。利用qBDA技術(shù)，閱爾基因?qū)σ后w活檢樣本進(jìn)行檢測(cè)，其最低檢測(cè)下限可達(dá)十萬(wàn)分之五，滿足MRD檢測(cè)所需的檢測(cè)靈敏度，同時(shí)檢測(cè)數(shù)據(jù)量又很少，可應(yīng)用于中低通量測(cè)序平臺(tái)，使檢測(cè)成本、硬件成本、時(shí)間成本都大大降低，滿足院內(nèi)去中心化檢測(cè)的需要，更有助于NGS檢測(cè)常規(guī)化的實(shí)現(xiàn)。

結(jié)語(yǔ)

      隨著人類(lèi)對(duì)腫瘤的認(rèn)識(shí)越來(lái)越深入，腫瘤的診療對(duì)分子檢測(cè)的依賴(lài)性越來(lái)越高，對(duì)于其檢測(cè)的要求也越來(lái)越精確，催生了檢測(cè)技術(shù)的不斷革新。NGS的發(fā)展與腫瘤基因檢測(cè)的發(fā)展緊密相隨，正是因?yàn)镹GS技術(shù)的成本不斷下降，以及檢測(cè)技術(shù)的不斷創(chuàng)新，才有腫瘤基因檢測(cè)市場(chǎng)的繁榮。未來(lái)腫瘤基因檢測(cè)發(fā)展的趨勢(shì)，必然是要求數(shù)據(jù)量合適，靈敏度高，特異性強(qiáng)，成本低，適用于中低通量測(cè)序平臺(tái)，這樣才能推向各級(jí)醫(yī)院，從而造福更多患者。歸根結(jié)底，滿足這些要求，需要向無(wú)數(shù)前賢智士學(xué)習(xí)，不斷推進(jìn)底層技術(shù)的創(chuàng)新，并將這些創(chuàng)新迅速應(yīng)用于臨床檢測(cè)。

      參考資料：

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2.Milestones in Cancer Research and Discovery - NCI

3.綜述 | 人類(lèi)腫瘤藥物發(fā)展史

4.PD-L1前世今生：從諾貝爾獎(jiǎng)?wù)f起_免疫

5.Meet John: Johns Hopkins Kimmel Cancer Center

6.華大基因想干大事：收購(gòu)美國(guó)測(cè)序儀公司CG 打通產(chǎn)業(yè)鏈

7.華大智造贏得對(duì)Illumina專(zhuān)利訴訟 獲賠3.34億美元

8.中國(guó)腫瘤分子診斷藍(lán)皮書(shū)

9.2022版非小細(xì)胞肺癌CSCO指南

10.Odegaard JI, Vincent JJ, Mortimer S, Vowles JV, Ulrich BC, Banks KC, et al., Validation of a plasma-based comprehensive cancer genotyping assay utilizing orthogonal tissue- and plasma-based methodologies. Clin. Cancer. Res. 2018, 24: 3539-3549.

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      關(guān)于閱爾基因

      閱爾基因是一家技術(shù)創(chuàng)新驅(qū)動(dòng)的全球基因組學(xué)公司，擁有多項(xiàng)革命性的分子檢測(cè)技術(shù)，可將所有NGS平臺(tái)的測(cè)序成本降低98%以上，并將qPCR、Sanger和納米孔測(cè)序的靈敏度提高100倍以上。閱爾基因在美國(guó)休斯頓、中國(guó)上海和中國(guó)蘇州均設(shè)有分部。閱爾基因的愿景是創(chuàng)造負(fù)擔(dān)得起的、及時(shí)的和準(zhǔn)確的基因分析工具，與諸多合作伙伴一起實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療并改善患者預(yù)后。